CAR T细胞疗法存在包括原发性或获得性耐药以及对实体瘤的疗效有限等重大障碍，而利用Cas9核酸酶进行基因组DNA切割又面临着严重的染色体易位或截断、染色体丢失或增加（非整倍体）以及p53活性的下调或丧失等“基因毒性”困境。如何安全且大规模地重编程T细胞功能，成为了下一代免疫疗法亟待突破的瓶颈。
2024年2月29日，斯坦福大学Lei S. Qi教授与Crystal L. Mackall教授团队在顶刊Cell发表重磅论文。研究团队开发了一个基于CRISPR-Cas13d的多重效应向导阵列（MEGA）平台，在不切割基因组DNA的前提下，成功在原代人类T细胞中实现定量、可逆和大规模多重基因敲低，并实现了免疫调节代谢途径的多重破坏，从而在体外和体内增强了CAR T细胞的适应性和抗肿瘤活性。
核心技术优化
优化Cas13d在原代人类T细胞中的表达与活性
为了确认慢病毒整合的RfxCas13d在原代人类T细胞中的功能活性，研究团队决定靶向功能失调的HA-28z CAR T细胞中LAG3、PD-1和TIM3的上调。在使用双顺反子CRISPR系统时，发现在293T细胞包装期间，RfxCas13d阵列加工或crRNA引导的慢病毒RNA切割，可能导致功能性病毒滴度低。
为此，团队确立了一套优化的工作流程：先用RfxCas13d和HA-28z CAR慢病毒共转导原代人类T细胞，随后再转导crRNA慢病毒。这种顺序转导策略规避了包装期间的降解，为后续的高效基因调控奠定了物质基础。
MEGA CAR T细胞强效抑制由强直（紧张性）信号驱动的耗竭标志物上调
为了验证MEGA HA-28z CAR T细胞能否抑制T细胞耗竭，研究人员设计了靶向LAG3、PD-1和TIM3的单个向导、靶向受体所有成对组合的双向导阵列或NT向导。流式细胞术与转录组分析显示，与非靶向（NT）对照组强烈的耗竭表型相比，MEGA系统精确且强效地将这些抑制性受体的上调幅度压制到了接近基线水平。
进一步测试包含所有三个靶点的三重向导阵列（LPT配置）时，成功在单细胞水平上大幅增加了LAG3阴性、PD-1阴性及TIM3阴性的“三重阴性”细胞亚群比例。
MEGA在原代人类T细胞中不表现出附带活性
RfxCas13d在某些哺乳动物细胞中靶向切割高表达转录本时，偶尔会引发非特异性的RNA降解（即附带活性）。为了彻底排除这一潜在毒性，团队靶向了原代人类T细胞中丰度极高的B2M转录本进行测试。
大样本RNA测序（Bulk RNA-seq）与流式分析表明，尽管B2M被高效敲低，但脱靶蛋白（如CD46、CD3）和mCherry报告基因的表达均未受影响，细胞活力也未见显著差异。此外，靶向组与对照组在线粒体RNA表达水平上无明显区别，强有力地证明了该系统在原代人类T细胞内具有极高的特异性与安全性。
MEGA帮助识别CAR T细胞增殖的成对调节因子
为了在原代T细胞中无偏见地发现具有协同作用的“耗竭相关”基因对，团队利用MEGA独有的多重优势进行了一项组合CRISPR筛选。研究人员构建了包含6400个向导阵列的定制文库，涵盖24个候选基因的全部576种成对组合。
通过在长期培养中追踪阵列丰度变化，研究团队不仅成功通过单次读取解析了紧凑的Cas13d阵列序列，还发现靶向FAS的双重敲低阵列（如FAS结合ZC3H12A、CTLA4或SOCS1）在长期培养中展现出了最显著的克隆富集，这与FAS在T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）中的关键促凋亡角色高度吻合——敲低FAS可显著降低T细胞在慢性刺激下的凋亡敏感性，从而赋予细胞更强的扩增优势。
功能机制验证
成对转录组扰动增强功能失调CAR T细胞的抗肿瘤活性
针对筛选出的基因对，团队开展了小规模的二次筛选。体外细胞因子分泌与肿瘤杀伤实验表明，相比于非靶向对照组，表达顶级双向导阵列（如CBLB + FAS）的HA-28z CAR T细胞在接触Nalm6-GD2肿瘤时，展现出显著增加的IFNγ与IL-2分泌能力。尤其在连续的肿瘤激发后，CBLB与FAS的成对敲低促使CAR T细胞维持了强劲且持久的肿瘤杀伤效力，而单基因敲低组和对照组则完全无法控制肿瘤生长。
MEGA能够快速、可调且可逆地扰动T细胞转录组
为了赋予该技术“开/关”能力，研究团队将大肠杆菌二氢叶酸还原酶的失稳定结构域（DD）融合至RfxCas13d的C端。通过添加FDA批准的小分子药物甲氧苄啶（TMP），RfxCas13d-DD被迅速稳定并发挥切割作用。
在靶向CD46的测试中，添加或撤除TMP的72小时内，CD46的表面表达呈现出了精准下调或完全恢复至基线水平的极速动力学。此外，在1至100 nM的给药浓度区间，该系统表现出类似模拟信号的线性剂量响应曲线，且并不影响细胞生存率和基因敲低效率。
▲ MEGA可以快速、定量且可逆地控制T细胞转录组。图源：参考文献[1]
调节近端信号传导分子可调控MEGA CAR T细胞活性
无需改变CAR受体的外部结构，MEGA同样能在细胞内部实现对CAR激活强度的微调。研究人员构建了靶向近端信号分子LCK和ZAP70的多重向导阵列（PROX）。在RfxCas13d-DD系统中，随着培养基中TMP浓度的增加，MEGA HA-28z CAR T细胞的IL-2分泌量和CD69表达水平呈高度依赖性的降低。
该策略在CD19-BBζ和ROR1-28ζ等不同构型的CAR T细胞中依然保持了卓越的调控效力，证明了通过调节近端信号可以打造出一个受体非依赖性的通用型“安全阀”。
MEGA可在原代人类T细胞中实现大规模多重基因敲低
为了探究多重靶向的技术极限，团队设计了一种一步克隆方案，组装了包含10个独立靶点（LAG3、FAS、CD5、ENTPD1、CD46、TRAC、B2M、CTLA4、PDCD1和HAVCR2）的SURF2超级向导阵列。基因组分析证实该长阵列在整合后异常稳定，未发生截断重组。
令人惊叹的是，在没有预先优化间隔区序列或位置的情况下，高维流式细胞术与转录组定量显示，SURF2阵列在单细胞水平上成功实现了10个靶标中9个转录本及8个表面蛋白的显著同时敲低。统计分析揭示，极低表面标志物表达的细胞群与SURF2阵列表达高度重合。
代谢工程突破
全通路破坏嘌呤代谢增强CAR T细胞效应功能
肿瘤微环境常常利用嘌呤能信号通路将炎症性ATP转化为免疫抑制性的腺苷（ADO），从而导致T细胞瘫痪。研究团队利用MEGA的并发敲低优势，构建了同时阻断该通路4个关键表面蛋白（CD39、CD73、A2AR和A2BR）的PURI阵列。
代谢物检测清晰显示，表达PURI阵列的CAR T细胞显著减缓了培养基中ATP的水解，并大幅减少了AMP及腺苷的积累。这种全通路层面的干预直接转化为了更强效的抗肿瘤反应，PURI修饰的CAR T细胞在抗原刺激下释放了显著高于对照组的IFNγ和IL-2，并显著提升了T细胞的杀伤与增殖潜力。
多重靶向有氧糖酵解改善CAR T细胞适应性并限制耗竭
从氧化磷酸化向有氧糖酵解的代谢转换虽然驱动了T细胞活化，但长期的糖酵解正是引发耗竭的核心推手。团队设计了同时靶向PI3K/Akt轴及下游核心糖酵解酶（AKT1、AKT2、HK1和HK2）的GLY 4重靶向阵列。
在高度耗竭的HA-28z CAR T细胞模型中，GLY阵列不仅成功抵消了糖酵解酶的病理性上调，还引发了深度的全局转录重编程。大样本RNA测序和高维质谱流式证实，GLY细胞显著下调了LAG3、PD-1、TIM3等多种抑制性受体，上调了组蛋白表达，成功将耗竭细胞推向了更具适应性的记忆型表型。
MEGA在代谢工程中的优势全面超越传统Cas9基因编辑
为了对比Cas13d敲低（Knockdown）与Cas9敲除（Knockout）在代谢重塑中的差异，团队利用传统Cas9 RNP体系对相同四个代谢基因实施了四重敲除（4KO）。两种方法的结果形成了鲜明对比：Cas9 4KO不仅导致CAR T细胞在培养过程中扩增能力显著下降，更在共培养实验中完全丧失了肿瘤清除功能。
转录组的深入分析给出了答案：Cas9多重敲除导致了DNA损伤通路与G2-M细胞周期检查点基因集的急剧上调，以及p53通路的显著下调——这正是多重Cas9切割引发基因毒性的典型分子印记，意味着细胞的基因组守护机制已遭到破坏。相比之下，采用Cas13d介导的MEGA系统完全避免了这种由DNA双链断裂引发的基因毒性，在保证细胞基因组完整性的前提下安全实现了深度的代谢重编程。
下调糖酵解活性可限制末端分化并强效提升体内外肿瘤清除率
基于上述极具前景的表型重塑，团队进一步在体内外评估了代谢调控带来的长期治疗效益。尽管在静态培养下表达GLY阵列的CAR T细胞分泌的细胞因子较为节制，但其在多次肿瘤再激发实验中展现出了惊人的杀伤持久力。在Nalm6-GD2荷瘤小鼠模型中，经过GLY修饰的细胞在回输前呈现出以中央记忆型（CM）为主的表型。
在给药后40天的随访观察中，非靶向（NT）对照组4只小鼠中无一实现肿瘤清除，而GLY组中75%（3/4）的小鼠实现了肿瘤的完全清除。外周血分析进一步证实，GLY敲低策略显著促进了CAR T细胞在体内的长期扩增与持久留存。
▲ 糖酵解破坏增强了MEGA HA-28ζ CAR T细胞在体外和体内的抗肿瘤活性。图源：参考文献[1]
研究总结
这项里程碑式研究，通过CRISPR-Cas13d多重转录组编辑平台（MEGA），成功突破了T细胞工程在"安全性"与"多重化"之间长期存在的技术瓶颈。该研究首次在不触及基因组DNA的条件下，在原代T细胞中实现了多达10个靶标的安全同步敲低，不仅揭示了组合基因筛选的巨大潜力，更证明了转录组层面的代谢通路精准干预（相比于存在基因毒性风险的DNA敲除）是重塑T细胞抗耗竭特性的有效策略。这标志着工程化T细胞治疗正从单一基因编辑，迈向安全、精准、大规模多重转录组重编程的新阶段。
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参考文献：
[1] Tieu, V. et al., A versatile CRISPR-Cas13d platform for multiplexed transcriptomic regulation and metabolic engineering in primary human T cells, Cell (2024). DOI: 10.1016/j.cell.2024.01.035
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