研究背景：RNP递送的独特优势与技术瓶颈

在CRISPR基因编辑的三类主要载荷形式（质粒DNA、mRNA+sgRNA、核糖核蛋白RNP）中，直接递送Cas9 RNP具有独特的理论优势：

• 瞬时核酸酶活性：RNP蛋白在细胞内通过蛋白酶体途径快速降解，核酸酶活性持续窗口短，从而降低脱靶编辑的累积风险。
• 无需转录翻译：无需依赖mRNA转录或蛋白翻译步骤，在静止期细胞（如原代T细胞）中同样有效。
• 低免疫原性：无病毒载体遗传物质整合风险，减少免疫激活，在反复给药场景中具有优势。

然而，RNP的LNP封装面临两个核心技术障碍：

• 蛋白变性问题：LNP制备通常涉及有机溶剂（如乙醇），常规Cas9（如SpyCas9，熔解温度Tm≈43°C）在此条件下极易变性失活，导致封装后活性大幅下降。
• 封装效率问题：RNP整体净负电荷密度低于裸核酸（尤其是短sgRNA系统），与脂质载体的静电相互作用弱，封装效率不稳定。
• 器官靶向局限：此前RNP的LNP递送几乎局限于肝脏靶向，对肺部等非肝脏实质器官的高效体内递送尚无成熟方案。

2024年10月16日，加州大学伯克利分校诺奖得主 Jennifer A. Doudna 教授与 Niren Murthy 教授团队在顶刊 Nature Biotechnology 发表重磅论文。研究团队通过定向进化开发出一种极具热稳定性的 iGeoCas9，结合经优化的生物可降解LNP配方，成功克服了RNP体内存活与封装难题。该系统通过单次静脉注射即可在小鼠模型中实现高达37%的肝脏编辑和16%的肺部编辑，有效纠正了多种致病基因，实现了CRISPR疗法从“运载核酸”到“直接运载功能蛋白”的划时代跨越。

突破一：定向进化构建热稳定高效 iGeoCas9

为何选择 GeoCas9 作为出发骨架

来自嗜热菌 Geobacillus stearothermophilus 的 GeoCas9 天然具备优异的热稳定性（熔解温度 Tm 约 55°C，显著高于 SpyCas9 的约 43°C），理论上能在 LNP 有机相制备条件下维持蛋白质折叠完整性。然而，尽管 GeoCas9 在体外生化实验中活性良好，野生型 GeoCas9 在哺乳动物细胞中编辑效率极低，原因在于其在哺乳动物细胞内低镁离子浓度条件下 DNA 解链速率不足，无法高效形成 R- 环结构以启动切割。

此外，野生型 GeoCas9 要求严格的 PAM 序列（5′-N₄CAAA-3′），可靶向的基因组位点受到较大限制。

定向进化策略与 iGeoCas9 的构建

研究团队基于细菌双质粒切割选择系统，对 GeoCas9 多个结构域进行随机诱变与筛选。通过两轮独立筛选，共鉴定出 8 个有益突变，分布于以下结构域：

• Rec 识别域（3个突变）：E149G、T182I、N206D
• RuvC 核酸酶域（1个突变）：P466Q
• 磷酸锁环（1个突变）：Q817R
• WED 楔形域（3个突变）：843K、E884G、K908R（对活性提升和 PAM 兼容性扩展起关键作用）

将这 8 个突变组合所得的复合突变体 iGeoCas9（R1W1），保持了约 55°C 的热稳定性，同时在哺乳动物细胞中的编辑效率相比野生型 GeoCas9 提升逾 100 倍。

机制上，WED 域突变增强了 iGeoCas9 与 DNA 双链的静电相互作用，加速了低镁离子浓度条件下的 DNA 解链和 R- 环形成速率——这正是野生型 GeoCas9 在哺乳动物细胞内活性低下的根本原因。WED 域突变同时放宽了 PAM 识别的严格性，使可靶向的基因组位点范围显著扩大，且整体脱靶率保持在低水平。

注：上述突变位点和结构域功能归因已由配套发表于 Cell (2024) 的 cryo-EM 结构研究独立验证（Chen et al., Cell 2024, DOI: 10.1016/j.cell.2024.04.003）。

突破二：pH 响应性 LNP 配方实现高效 RNP 封装与内体逃逸

核心配方创新：酸降解 PEG 脂质（ADP-2k）

标准 LNP 配方采用稳定 PEG 脂质，其 PEG 外壳在内体阶段持续存在，阻碍膜融合与内体逃逸，并可能引起与 PEG 相关的细胞毒性。研究团队将实验室合成的 pH 敏感、酸可降解 PEG 脂质（ADP-2k）引入配方。ADP-2k含有 pH 敏感的乙酰酯连接键，在晚期内体酸性环境（pH 5–6）中快速水解脱落，从而：

• 在循环阶段维持 LNP 胶体稳定性（均匀粒径 170–180 nm），防止聚集；
• 在内体阶段 PEG 层快速降解，暴露脂质核心，大幅促进内体膜破坏和 RNP 向胞质的释放；
• 细胞活力维持在 >90%，显著优于含阳离子脂质 DOTAP 的传统配方（易引起免疫应激）；
• 优化后的 RNP-LNP 复合物在 4°C 储存超过 1 个月后仍保持高编辑活性，具备良好的储存稳定性。

iGeoCas9 sgRNA 的结构优势辅助封装

iGeoCas9 所匹配的延伸型sgRNA（约 139 nt，相比常规 sgRNA 约 100 nt）赋予了 RNP 更高的整体负电荷密度，改善了与 LNP 可电离脂质之间的静电相互作用，提高了封装效率与封装均一性——这是该系统有别于 SpyCas9 RNP-LNP 体系的另一结构优势。

突破三：多细胞系高效编辑与精准 HDR

多细胞类型与靶点覆盖

▲ iGeoCas9 RNP-LNP 复合物在多种细胞系和基因组靶点中的编辑效率。图源：参考文献[1]

iGeoCas9 RNP-LNP 系统在多种细胞类型中展现出宽泛的靶点兼容性，编辑效率因靶点和细胞类型不同，覆盖 4%–99% 的范围。同等条件下，iGeoCas9 RNP-LNP 的细胞内编辑效率比 SpyCas9 RNP-LNP 高出两倍以上，而 iCas12a RNP-LNP 几乎未产生可检测编辑信号——印证了 iGeoCas9 热稳定性在LNP 封装过程中的关键作用。

RNP + ssDNA 共递送实现高效同源定向修复（HDR）

基因治疗中，精准序列替换（即 HDR）往往比基因敲除具有更高的临床价值。研究团队尝试利用同一 LNP 颗粒共封装 iGeoCas9 RNP 与单链 DNA（ssDNA）供体模板，并发现一个重要的物理特性：

ssDNA 加入后，通过与 Cas9 RNP 的瞬时结合，将 LNP 粒径从约 180 nm 收缩至 140–150 nm，有效防止颗粒聚集，提升体系稳定性。

主要 HDR 结果如下：

• GFP→BFP 报告系统（HEK293T 细胞）：RNP + ssDNA 共递送诱导 20%–40% HDR 效率。
• 内源性基因组位点（EMX1 和 AAVS1）：NGS 测序证实 HDR 效率最高达 66%（同一样品总编辑效率高达 95%）。
• 囊性纤维化致病突变修复（CFTR 基因，病人来源人支气管上皮细胞）：针对 G542X 和 W1282X 致病突变的 HDR 效率约为 7%，为此类难转染原代细胞中的基因修复研究建立了重要的概念验证。

注：HDR 效率受细胞周期阶段、供体模板设计、ssDNA 剂量及靶点位置等多因素影响；7% HDR 效率见于原代人支气管上皮细胞，此类细胞的基线转染难度远高于 HEK293T。

突破四：新型可电离脂质筛选大幅提升递送效率

早期配方依赖 DOTAP 阳离子脂质，虽然封装效率尚可，但体内容易引发固有免疫应激，转化价值有限。研究团队在增强型 ssDNA（enhDNA）辅助下，对 13 种商业或自主合成的可电离脂质进行了系统筛选，最终锁定两种最优配方：

值得特别指出的是，与 mRNA+sgRNA 的 LNP 递送方案相比，RNP 递送在低剂量下显示出明显的效率优势，且无需对 sgRNA 进行高度化学修饰。mRNA 递送方案在低剂量条件下依赖 sgRNA 的高度修饰以维持稳定性，而 RNP 体系的编辑效率对 sgRNA 化学修饰不敏感，从而规避了核苷酸修饰带来的额外成本和工艺复杂性。

突破五：单次静脉注射实现肝脏与肺部体内基因编辑

▲ iGeoCas9 RNP-LNP 单次静脉注射后肝脏与肺部的体内编辑结果。图源：参考文献[1]

基于体外优化数据，研究团队对 FX12 和 FC8 进行微调，分别得到肝脏靶向配方 FX12m 与肺部靶向配方 FC8m，并通过小鼠单次眶后静脉注射（剂量：FX12m 约 4.6 mg/kg RNP，FC8m 约 2.3 mg/kg RNP）进行体内挑战：

治疗相关靶点的体内验证

为评估临床转化潜力，研究团队进一步针对两个具有明确疾病关联的基因进行体内编辑，以 NGS 测序定量结果：

• PCSK9（遗传性高胆固醇血症相关靶点）：单次给药后，小鼠肝脏 PCSK9 基因平均编辑效率为 31%，与已报道的其他先进递送系统处于同等水平（参考文献[1]引用比较数据）。
• SFTPC（家族性间质性肺病相关基因）：肺部 SFTPC 基因平均编辑效率为 19%，是迄今非病毒或病毒递送策略中针对该靶点报道的最高水平之一。

注：上述体内结果来自野生型 C57BL/6小鼠模型。体内编辑效率受给药途径、动物遗传背景及靶组织可及性影响，向其他物种或疾病模型的外推需独立验证。

科学意义与展望

这项研究的核心贡献在于通过两条技术路线的协同创新，突破了LNP-RNP 体内递送长期面临的双重瓶颈：

• "蛋白质热稳定进化"路线：通过定向进化将嗜热酶热稳定性的天然优势转化为哺乳动物细胞高效编辑能力，为 RNP 耐受 LNP 制备条件提供了蛋白质工程解决方案。
• "智能脂质化学设计"路线：pH 响应性酸降解脂质在血循环稳定性与内体逃逸效率之间实现了精准平衡，同时规避了传统阳离子脂质的体内免疫毒性问题。

两条路线共同实现了无需体外细胞操作、无需病毒载体、单次静脉注射即可在多器官产生临床意义量级的基因编辑效率。这一概念验证研究为下一代直接体内基因药物（in vivo genetic medicines）奠定了重要的技术基础。

该研究同时表明，通过脂质配方的定向微调可实现器官特异性靶向选择性（肝脏 vs 肺部），这一策略有望推广至中枢神经系统、肌肉、眼等其他器官，是体内递送领域的核心演进方向之一。

从前沿科研到日常实验：晟迪生物标准化工具

上述 Doudna & Murthy 团队的研究代表了 RNP-LNP 递送领域的技术前沿。对于当前更广泛应用的 mRNA+sgRNA 体外共递送场景，晟迪生物已将同类 LNP 技术转化为开箱即用的标准化工具：

本系列后续文章将持续聚焦LNP基因编辑领域的最新进展，敬请关注！

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关于晟迪生物

晟迪生物专注于以自主创新的纳米载体技术为核心，推动RNA疗法及其他合成生物学技术的创新研究与临床转化。公司建立了人工智能与合理实证驱动的全链条LNP递送技术解决方案（TLS），拥有核心脂质材料库、NeoLNP™系列试剂盒（干细胞/免疫细胞/动物体内RNA转染）和RNA序列设计模型，并成功开发了以肺部雾化吸入、皮肤局部给药为代表的i-Core LNP™肝外靶向RNA递送方案。

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